© 2024 SURF
Het bacteriële immuunsysteem, CRISPR/Cas, is 7 jaar geleden voor het eerst beschreven met de suggestie dat dit systeem in de wetenschap gebruikt zou kunnen worden voor het maken van plaatsspecifieke mutaties. Dit consortium is 4 jaar geleden begonnen met de optimalisatie en toepassing van de CRISPR/cas techniek in planten en om de mogelijkheden voor het gebruik in de plantenveredeling te onderzoeken. Daarvoor hebben we gebruik gemaakt van onze modelplanten Petunia, tomaat en polyploïde gewassen zoals aardappel en aardbei. Om het CRISPR/Cas proces te kunnen toepassen zijn vele stappen nodig en die hebben we in dit project ontwikkeld. Voor processen zoals het maken van plantprotoplasten, planttransformatie en plantregeneratie hebben we nieuwe protocollen ontwikkeld. Daarnaast hebben we op DNA niveau voor het ontwerp van guideRNAs, de klonering van guideRNAs en cas9-gen, en de detectie van mutanten, snelle en eenvoudige protocollen ontwikkeld waardoor we nu in staat zijn dit kloneringsproces in 1 week te doorlopen. Uiteindelijk hebben we mutaties in het DNA van petunia, tomaat en aardappel gemaakt op de vooraf bepaalde plekken en daarmee bewezen dat deze techniek goed toe te passen is in de plantwetenschappen en plantenveredeling. Zelfs in polyploïde gewassen, die moeilijk te veredelen zijn, werkt het CRISPR/Cas systeem goed omdat meerdere allelen tegelijkertijd gemuteerd kunnen worden. Een lastig punt in de gehele procedure blijft de regeneratie van planten uit protoplasten. Dit is een zeer langzaam proces dat vele maanden kan duren en de slagingspercentages zijn helaas ook aan de zeer lage kant (< 1%), ondanks onze verbeteringen.
De CRISPR/cas technologie hebben we onder andere toegepast in petunia om genen die betrokken zijn bij de bloemkleur, -geur en -vorm te muteren en zo de plant nieuwe eigenschappen te geven die van belang voor de veredeling van siergewassen. Het onderzoek naar bloemgeur productie wordt voortgezet in een promotieonderzoek van de junior onderzoeker die een groot deel van dit project opgezet en uitgevoerd heeft.
Daarnaast is de CRISPR/Cas technologie ingezet om planten te maken die resistent zijn tegen ziekten en plagen, door middel van het uitschakelen (muteren) van zogeheten S(susceptibility) genen. Dit onderzoek zijn we in petunia gestart en wordt nu voortgezet in een nieuw onderzoeksproject met het siergewas Alstroemeria.
Er zijn ook andere cas-enzymen beschreven in de literatuur met een andere functie, zoals cas13a. Dit herkent geen DNA maar RNA en in de literatuur is beschreven dat dit enzym gebruikt wordt bij de detectie van humane virussen zoals Dengue en Zika. In dit project hebben we de eerste stappen gezet om dit cas13a ook te kunnen gebruiken voor de detectie van plantpathogenen die in de zaadveredeling een groot probleem zijn en waarbij vroege en nauwkeurige detectie van zaad dat besmet is met pathogenen, van groot belang is. De eerste resultaten zijn veelbelovend, maar er is verder onderzoek nodig voordat dit detectiesysteem ook daadwerkelijk toegepast kan worden bij plantpathogenen. Enkele andere nieuwe toepassingen hebben we ook in het project opgenomen om hun werkzaamheid in planten te bestuderen, zoals nieuwe nucleases, base-editors en de mogelijkheid om genen op een vooraf bepaalde plek in het genoom te introduceren door middel van Homology-Directed Repair. Deze protocollen liggen nu klaar voor toepassing in het hierboven genoemde promotieonderzoek.
Samenvattend hebben we met ons onderzoek laten zien dat de CRISPR/Cas techniek voor plaatsspecifieke mutagenese, relatief eenvoudig toegepast kan worden in het plantenonderzoek en plantenveredeling. Zelfs in moeilijk te veredelen gewassen zoals polyploïden, wat de meeste voedsel- en siergewassen zijn, werkt deze methode. Nu we de CRISPRmutagenese kunnen toepassen in planten is het ook gemakkelijker om de nieuwste CRISPR/cas enzymen en -tools te onderzoeken. De benodigde protocollen en werkwijzen liggen nu klaar!
Aanleiding
De Nederlandse zaad- en plantenveredelingsbedrijven staan internationaal aan de top. Om deze goede concurrentiepositie te behouden zijn innovaties in de veredelingstechnieken noodzakelijk, zoals moleculaire veredeling. Op dit moment is er in het werkveld behoefte aan een methode waarmee men heel specifiek, op één plaats in het DNA, een mutatie kan aanbrengen ('targeted mutagenesis'). Zeer recent is hiervoor een nieuwe, veelbelovende methode beschreven, namelijk de CRISPR/Cas-technologie. Met deze techniek kunnen de bedrijven relatief eenvoudig veel preciezer en sneller veredelen, waardoor de internationale concurrentiepositie behouden blijft. Verschillende veredelingsbedrijven en onderwijsinstellingen willen daarom de toepasbaarheid van deze nieuwe technologie onderzoeken.
Doelstelling
Het programma wil vaststellen wat de toepasbaarheid van de CRISPR/Cas-technologie is en welke potentie deze technologie heeft in gewassen die van belang zijn voor de Nederlandse zaad- en plantenveredelingsbedrijven. Het onderzoek bestaat uit twee fasen:
1) de techniek wordt getest en geoptimaliseerd in het modelgewas petunia en aanverwante soorten zoals tomaat en aardappel.
2) het onderzoeksteam past de techniek toe in gewassen die voor de bedrijven commercieel interessant zijn, zoals gewassen uit de familie van de Solanaceae, Brassicaceae en Cucurbitaceae.
In het onderzoek worden diverse specialistische instrumenten en methodes ingezet en uitgetest (in combinatie met de CRISPR/Cas-technologie).
Beoogde resultaten
Na afloop van het project zijn er:
1) nieuwe protocollen voor het toepassen van de CRISPR/Cas-technologie in petunia, Solanaceae, Brassicaceae en Cucurbitaceae;
2) nieuwe vectoren (dragers) voor het maken van de plaatsspecifieke mutaties;
3) methoden voor het aantonen van de mutaties op DNA-niveau;
4) mutante petunia's waarvan de bloemkleur, bloemgeur, bloemvorm of de aanwezigheid van trichomen ('haren') zijn veranderd;
5) mutante Solanaceae-, Brassicaceae- en Cucurbitaceae-planten waarvan de plantvorm, de inhoudsstoffen of de gevoeligheid voor een ziekte is veranderd.
De lector Green Biotechnology van Hogeschool InHolland stuurt met (docent-)onderzoekers het project aan. De studenten van de betrokken hogescholen participeren binnen het reguliere onderwijs (projectonderwijs) en via stage- en afstudeeropdrachten in het onderzoek. Al tijdens het onderzoeksproject vindt de implementatie van de technologie in het onderwijs plaats. De consortiumleden wisselen maandelijks ervaring, materialen en protocollen uit. Het gehele consortium komt minstens 2 keer per jaar bijeen om de resultaten en voortgang te bespreken.