Vitrifying Cells: it takes Two to Tango

Structurele en functionele kennis van eiwitten, die essentieel zijn in biologische processen, is fundamenteel voor ons begrip van de Chemie van het Leven. De structurele biologie heeft de afgelopen jaren een aantal revoluties doorgemaakt. De techniek van cryo-elektronen microscopie maakt het mogelijk om de structuren van gezuiverde macromoleculen in oplossing te bepalen (single particle analysis, SPA). Computationele technieken gebaseerd op deep-learning leveren systematische voorspellingen van een miljoen driedimensionale eiwitstructuren. Cryo-elektronentomografie, gecombineerd met sub-tomogram averaging, maakt het mogelijk om conformaties van grote macromoleculaire complexen te onderzoeken.
Wij verwachten dat in situ structurele biologie, waarbij we de structuren van macromoleculaire complexen direct in de cel bestuderen, voor een volgende revolutie zal zorgen in dit vakgebied. Hiervoor dienen de samples (cellen, weefselplakken, organoïden) echter eerst vitreus ingevroren te worden: het sample moet snel genoeg gekoeld worden om de vorming van kristallijn ijs te voorkomen. Eerder ontwikkelden we de technologie om SPA-samples te vitrificeren met behulp van cryogene jets. In dit project hebben we de jetting-technologie verder geoptimaliseerd zodat mogelijk ook cellen kan vitrificeren. Cruciale aspecten zijn de snelheid van de jets en de timing en reproduceerbaarheid van de jets die op het sample aankomen. Hiervoor hebben we een nieuwe generatie van de ethaanjet, een kerncomponent van ons apparaat, ontworpen, gebouwd en uitgebreid gekarakteriseerd. Zo konden we het vitrificatiepotentieel en de reproduceerbaarheid verhogen. Deze technologie zal in situ structurele biologische studies verbeteren die noodzakelijk zijn om de Chemie van het Leven te begrijpen.

Structural and functional knowledge of proteins, which are essential in biological processes, is fundamental for our understanding of the Chemistry of Life. Structural biology - the field that studies the structure and function of proteins – has seen several revolutions over the last few years. Single particle analysis (SPA), where individual macromolecular assemblies are imaged under cryogenic conditions within highly automated electron microscopes, has been used to elucidate the structures of many novel and important proteins and complexes. Deep-learning–based computational techniques provided systematic predictions of an million three-dimensional protein structures. Cryo-electron tomography (ET) combined with sub-tomogram averaging (STA) enabled the investigation of conformational states of large macromolecular complexes. We expect in situ structural biology, where macromolecular assemblies are studied within the interior of focused-ion-beam milled frozen cells, to become the next revolution in our field. Such revolution would require well prepared vitreous samples (cells, tissue slices, organoids): the sample should be cooled fast enough to prevent the formation of crystalline ice. Previously, we developed the technology to prepare SPA samples using jets of cryogenic fluid directed onto the sample. This device, the VitroJet, has been further developed into a commercial product by CryoSol-World and has been sold worldwide. Here, we wish to advance the jetting technology such that it can vitrify cells. Crucial aspects are the speed of the jets and the timing and reproducibility of the fronts of the cryogens arriving onto the sample. We will design, build, characterise and refine a next generation of the ethane cup, a core component within the VitroJet. If successful, we should be able to increase its vitrification potential as well as its reproducibility by more than one order of magnitude. This technology will enable in situ structural biology studies necessary to understand the Chemistry of Life.